徕卡显微镜动态超分辨率显微镜

超分辨率显微镜技术彻底改变了生物学，因为在过去十年。 在他们的帮助细胞组分现在可以在蛋白质的大小可视化。 然而，成像活细胞是对于大多数的超分辨率的原则是一个挑战。 在这方面，一个名为uPAINT（通用积分累积成像纳米级地形）技术抓住了关注。 此单分子方法利用连续标记，任意生物分子膜的动态成像在活细胞中以非常高的密度以显示超分辨的图像和单个分子的轨迹。 定位显微镜 例如STORM，dSTORM / GSDIM或（SPT）的PALM基于本地化超分辨率技术基于时间去相关的荧光。 通过实现分离的分子“发射，随后将其定位与subdiffraction精度可以用来重建超分辨的图像。 为了使这些方法来工作，视场内的分子的绝大多数必须处于非发光状态。 为了实现荧光发射的时间分离，制定了几种方法： STORM（随机光学重建显微镜）方法，通过将大多数人口的进入一个黑暗的状态，具有高功率激光照明的帮助下实现单分子的时间分辨荧光.为了使这种方法的工作样品必须被嵌入在氧化或还原缓冲剂以稳定的荧光团的断开状态。 随机的分子的一个亚群逸出从暗状态和发出荧光。 这种“对速度”可以是微调由围绕标本和照明与第二激光（405纳米）的解决方案，它减少了在关闭状态的寿命。 PALM（图片激活定位显微镜）技术采用光活化/敞篷荧光蛋白，可以“变身”开和关。激活后，他们进行成像，直到他们漂白。 在这种情况下，激活光源的强度决定了荧光激活率。 用定位显微镜技术的帮助下，一个子衍射分辨率达到和细胞组分可在前所未有的细节进行可视化。 然而存在用于这些类型的方法实现，即天然蛋白质的超分辨图像上活细胞的一个重大挑战。 当研究人员要求，研究内源性蛋白在高密度在活细胞中，无论是STORM 也PALM技术完美地完成所有必需的前提条件。在基于STORM的情况下，接近降低成像缓冲区与活细胞不兼容。 PALM又取决于遗传修饰的嵌合光活化的荧光蛋白质的利用率，从而内源性蛋白不能被观察到。 通用积累点成像的纳米地形（uPAINT）是一个复杂的技术规避这些问题。它的工作原理是动态成像单分子轨道上下偏斜照明细胞表面，因此导致在超分辨的天然生物分子的行为的跟踪，在活细胞的表面上。 相比之下，传统的定位显微镜方法，其利用用于成像的分子的一小部分随机的荧光发射，uPAINT由成像低浓度的荧光配体，因为它们结合，并与它们的靶相互作用的小光量内实现荧光信号的时间分离。 该uPAINT原则 通用PAINT追溯到原来的做法称为漆 （点积累的成像纳米拓朴图）。用于此目的的荧光标记的探针扩散在溶液中，并开始在结合到感兴趣的对象，以发出荧光。阿列克谢Sharanov和Robin Hochstrasser通过连续靶向脂质双层和大单层囊泡与尼罗红是不发荧光的水溶液而开始发荧光在疏水环境中引入这种方法。在水中快速分子扩散导致尼罗红的恒定通量在膜的附近。随后出现从它进入膜的时刻的荧光信号。在这种新的环境探测成为荧光和流动性急剧下降，使得其检测带摄像头（几毫秒），直到光漂白发生。 通过确定每个单独的荧光信号，大约分辨率的心25（nm）是可能的。 然而，由于非常短的持续时间插入（毫秒）就不可能追踪单个分子在长时间内的行为。（奥林巴斯显微镜） 后来格雷戈里Giannone和Eric Hosy重点，克服一些原漆技术的局限性。 通过使用特定的荧光配体（即抗体）代替非特异性膜染料，单，特定蛋白质相互作用的动态成像成为可能。由于更广泛的应用带宽，这种方法被命名为通用PAINT。 对于这种技术背景未结合标记的配体存在于培养基中的荧光，通过使用斜光 （图1）克服。从转移其预期使用TIRF激光是关键。发送激光略低于临界角向载玻片导致了“ 高度倾斜和层压光学片 ”（HILO）倾斜穿过试样的形成。 本卷中只有荧光很兴奋。 低浓度的标记的配体加入到介质洗澡的检体内部的缓冲器。布朗扩散导致配体在细胞表面的连续和随机结合到它们的目标。希洛光路内只荧光很兴奋和成像（图1）。

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